高通量测序技术主要内容：

1. 主流测序技术及其原理
   • 一代：
     • Sanger测序，读段较短，准确性高，通量低
   • 二代：
     • Illumina，读段短，准确性高，通量高
     • 华大智造，读段短，准确性高，通量高
   • 三代
     • PacBio，读段长，单分子，通量高（通过HiFi技术提高准确率）
     • ONT，读段长，单分子，通量高（通过更新试剂和算法提高准确率）
2. 预处理内容及代表性工具
   • 质控：FastQC、MultiQC
   • 预处理
     • 去除低质量碱基
     • 去除接头序列
     • 代表性工具：Trimmomatic、cutadapt、fastp
3. 基因组测序及数据分析
   • 从头测序
     • 应用：全新物种或基因组变化较大的物种
     • 建库：三代长读段更有利于组装
     • 组装结果为contig，即一段连续的一致性序列（不含有gap）
     • 组装结果评价指标主要为N50，对contig大小从大到小排序后累加，直到达到contig总大小一半为止，最后添加的contig大小即为N50值
     • 组装算法：
       • OLC：需读段两两比对建图，找哈密顿通路，代表性工具有CA、canu
       • DBG：对读段进行k-mer子串分割建图，找欧拉通路，代表性工具有Velvet、SOAPdenovo、wtdbg2
   • 重测序
     • 应用：找突变
     • 建库：
       • WGS提取全基因组DNA即可进行二代/三代测序
       • 靶向重测序：基于杂交捕获（需更多起始DNA）或扩增子捕获（起始浓度低）；CRISPR切割适用于三代测序；一般有全外显子和panel两种形式
     • 数据分析：
       • 读段比对：先快速索引，随后用动态规划延伸，定位最优比对位置
         • 基于哈希：速度慢，内存高，敏感性高，代表性工具MAQ
         • 基于BWT：速度快，内存低，敏感性低，代表性工具BWA、bowtie
         • 比对结果：SAM格式
       • 突变鉴定：
         • 标记PCR重复
         • SNV/indel：基于错配或gap
         • CNV/SV：基于读段对的比对距离和方向、读段断裂比对、读段覆盖深度不一致或组装结果
         • 突变结果：VCF格式
4. 表观组测序及数据分析
   • 蛋白互作组（组蛋白修饰、TF结合）
     • ChIP-seq
       • 建库：甲醛交联固定，超声打碎DNA，目标蛋白抗体免疫共沉淀，测序；对照样本通常为input或IgG非特异性IP
       • 分析：读段比对，peak calling，peak注释；单末端测序在peak calling过程中需设置fragment长度，而双末端不需要；
     • CUT&RUN/CUT&Tag
       • 建库：抗体与核酸酶共孵育，可同时切割并共沉淀；所需起始材料少，测序深度低；低深度文库可用SEACR进行peak calling；
   • DNA甲基化组
     • 酶切处理
       • 利用限制性内切酶是否对甲基化敏感的特点
     • 亲和富集
       • MBD或5mC抗体
       • 数据分析同ChIP-seq
     • 重亚硫酸盐处理
       • 未甲基化的C会被转化成U
       • 比对需用特殊软件，基于CT或GA错配确定甲基化水平
       • 分辨率最高，可检测基因组上单碱基C的甲基化水平
     • 三代测序直接检测：PacBio或NanoPore
   • 染色质可及性
     • ATAC：
       • 建库：利用Tn5富集开放的DNA区域；通常需为双末端测序；
       • 分析：读段比对；peak calling（需注意Tn5切割位置偏移问题）；peak注释；TF足迹分析；
5. 转录组测序及数据分析
6. 单细胞转录组测序
7. 单细胞表观组测序
8. 免疫组库
9. 微生物组
   • 扩增子
   • 宏基因组

基因组测序思维导图：

表观组测序思维导图：